HPV tip 16 nakon tretmana

Povezana i preporučena pitanja

18 odgovora

Pronađite stranicu

Što ako imam slično, ali drugačije pitanje?

Ako niste pronašli podatke potrebne za odgovor na ovo pitanje ili je vaš problem malo drugačiji od gore navedenog, pokušajte postaviti liječniku sljedeće pitanje na ovoj stranici kada se odnosi na glavno pitanje. Možete postaviti i novo pitanje, na koje će naši liječnici odgovoriti nakon nekog vremena. Besplatno je. Na toj stranici možete naći i slične podatke ili na stranici za pretraživanje. Vrlo smo zahvalni ako nas na društvenim mrežama preporučite svojim prijateljima.

Medportal 03online.com Provode medicinske konzultacije u skladu s lokalnim liječnicima. Ovdje ćete pronaći odgovore stvarnih stručnjaka iz svoje regije. Trenutno se zemlja savjetuje o 45 područja: alergolozi, venereologija, gastroenterologija, hematologija i genetika, ginekolog, homeopat, dermatolog djeca ginekolog, dječja neurologija, pedijatrija, kirurgija, pedijatrija, endokrinolozi, nutricionisti, imunologija, zarazne bolesti, zarazne bolesti, zarazne bolesti, Logoped Laura, mamolog, liječnik, pravnik, narkolog, neuropatolog, neurokirurg, nefrolog, onkolog, onkolog, ortoped, oftalmolog, pedijatar, plastični hirurg, proktokolog, psihijatar, psiholog, pulmolog, reumatolog, seksolog i urolog, farmaceut, farmaceut, farmaceut Kirurg, endokrinolog.

Odgovaramo na 94,79% pitanja.

RU2492240C2 – Stabiliziran konstitutivno visok ekspresijski vektor za HPV cjepivo i rekombinantne bakterije mliječne kiseline transformirane ovim vektorom – Google Patenti

vrsta

  • C – HEMIJA; METALURGIA
  • C12 – BIOHEMIJA; PIVO; alkoholna pića; VINO; ocat; Mikrobiologija; Enzymology; Mutacija ili genetski inženjering
  • C12N – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; KULTURNI MEDIJI
  • C12N15 / 00 – mutacija ili genetski inženjering; Genetski povezana DNA ili RNA, vektori, npr. Plazmidi ili njihova izolacija, priprema ili pročišćavanje; Za to upotrijebite domaćine
  • C12N15 / 09 – Rekombinantna DNA tehnologija
  • C12N15 / 63 – uvođenje stranog genetskog materijala pomoću vektora; vektori; Upotreba domaćina u tu svrhu; Kontrola izraza
  • C12N15 / 74 – E. coli, npr. Lactobacillus, Micromonospora
  • C12N15 / 746 – E. coli, na pr Lactobacillus, Micromonospora za bakterije mliječne kiseline (Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Propionibacterium, Bifidobacterium, Sporolactobacillus)
    • A – LJUDSKE POTREBE
    • A61 – MEDICINSKA ILI ŽIVOTINJA; higiena
    • A61K – pripravci za medicinsku, zubarsku ili WC upotrebu
    • A61K39 / 00 – Lijekovi koji sadrže antigene ili antitijela
    • A61K39 / 12 – virusni antigeni
      • A – LJUDSKE POTREBE
      • A61 – MEDICINSKA ILI ŽIVOTINJA; higiena
      • A61K – pripravci za medicinsku, zubarsku ili WC upotrebu
      • A61K39 / 00 – Lijekovi koji sadrže antigene ili antitijela
      • A61K2039 / 51 – Medicinski virusi / DNA / RNA virusi
      • A61K2039 / 52 – Bakterijske stanice; Gljivične stanice; protozoa
      • A61K2039 / 523 – Bakterijske stanice; Gljivične stanice; Protozojske stanice koje eksprimiraju strane proteine
        • A – LJUDSKE POTREBE
        • A61 – MEDICINSKA ILI ŽIVOTINJA; higiena
        • A61K – pripravci za medicinsku, zubarsku ili WC upotrebu
        • A61K39 / 00 – Lijekovi koji sadrže antigene ili antitijela
        • A61K2039 / 54 – Ponuda lijekova načinom uporabe
        • A61K2039 / 541 – sluznica
        • A61K2039 / 542 – Oralna ili gastrointestinalna brava
          • C – HEMIJA; METALURGIA
          • C12 – BIOHEMIJA; PIVO; alkoholna pića; VINO; ocat; Mikrobiologija; Enzymology; Mutacija ili genetski inženjering
          • C12N – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; KULTURNI MEDIJI
          • C12N2710 / 00 – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; KULTURA MEDIJE dsDNA virusi
          • C12N2710 / 00011 – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; MEDIJI KULTURE dsDNA virusi dsDNA virusi
          • C12N2710 / 20011 – Papillomaviridae
          • C12N2710 / 20034 – Upotreba virusa ili virusne komponente kao cjepivo, npr. virusi oštećeni ili inaktivirani, VLP, virusni protein
            • C – HEMIJA; METALURGIA
            • C12 – BIOHEMIJA; PIVO; alkoholna pića; VINO; ocat; Mikrobiologija; Enzymology; Mutacija ili genetski inženjering
            • C12N – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; KULTURNI MEDIJI
            • C12N2710 / 00 – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; KULTURA MEDIJE dsDNA virusi
            • C12N2710 / 00011 – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; MEDIJI KULTURE dsDNA virusi dsDNA virusi
            • C12N2710 / 20011 – Papillomaviridae
            • C12N2710 / 20041 – Čestice virusa ili virusni elementi kao vektori
            • C12N2710 / 20045 – Posebni ciljni sustav za virusne vektore
              • C – HEMIJA; METALURGIA
              • C12 – BIOHEMIJA; PIVO; alkoholna pića; VINO; ocat; Mikrobiologija; Enzymology; Mutacija ili genetski inženjering
              • C12N – MIKROORGANIZMI ILI ENZIMI; VAŠ SASTAV; RASPRAVA, ZAŠTITA I ODRŽAVANJE MIKORORGANIZMA; Mutacija ili genetski inženjering; KULTURNI MEDIJI
              • C12N2810 / 00 – vektori koji ciljaju grupu
              • C12N2810 / 50 – Podržava, izveden iz definiranih proteina
              • C12N2810 / 55 – Ciljne bakterije dobivene iz tvari
              • opis

                Predloženi izum odnosi se na površinski ekspresijski vektor za proizvodnju terapijskih cjepiva protiv humanog papiloma virusa (HPV), pri čemu površinski ekspresijski vektor sadrži gen koji sadrži mutirani repE protein koji ima aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 1, promotor, složenu gli-glutamat sintazu i gen povezan sa složenim genskim sinteznim genom za poligammaglutamat i kodira antigenski humani humani papiloma virus povezan s indukcijom tumora.

                Poznato je da proizvodnja stranih proteina korisnih za ekspresiju stranih proteinskih masa ovisi o broju kopija gena, odnosno broju plazmida i snazi ​​promotora koji se koristi za usmjeravanje transkripcije. Objavljeno je da se ekspresija ciljnog proteina povećava variranjem plazmidnih vektora u svakoj od bakterija, kao dodatak najčešće korištenom promotoru visoke ekspresije (Tomio, M. i sur., Appl Microbiol Biotechnol 28: … 170, 1988). ). Također su izvijestili da rep mutacije u mini-F plazmidu može promijeniti broj plazmida u različitim bakterijama (Yasuo, K. i sur., J. Biol Chem., 267: 11520, 1992).

                Procijenjeni humani papiloma virus (HPV) zarazio je više od 50% odrasle populacije u svijetu. Očekuje se da će četiri vrste HPV-a, uključujući HPV 16, 18, 31 i 45, rezultirati s više od 80% karcinoma grlića maternice (Lowy, DR i sur., Proc Nat Acad Sci, 91: ….. 2436 , 1994)). ).

                Rak grlića maternice kod žena je drugi najčešći rak nakon karcinoma dojke, prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO), ali širom svijeta svake godine otkriva više od 500.000 novih slučajeva raka vrata maternice i više od 300.000 pacijenata širom svijeta. Umiranje od raka vrata maternice. Rak grlića maternice, posebno u zemljama u razvoju, jedan je od vodećih uzroka smrti žena (Pisani, P. i sur., Int J. Cancer, 55: 891, 1993). Izvješće IARC-a pokazalo je da je broj bolesnika s kroničnom HPV infekcijom u zemljama u razvoju znatno veći nego u razvijenim zemljama i da je najučinkovitiji način iskorjenjivanja HPV infekcije upotreba profilaktičkih cjepiva protiv HPV-a.

                Razvoj cjepiva protiv raka grlića maternice usredotočio se na dvije vrste profilaktičkih cjepiva i terapijskih cjepiva. Cilj profilaktičkih cjepiva je jači neutralizirajuće antitijelo na antigen HPV L1 / L2, koji omogućuje domaćinu da spriječi infekciju HPV zaštitom i spriječi napredovanje bolesti, čak i ako je već zaražena. S druge strane, terapijsko cjepivo usmjereno protiv HPV-a E6 / E7 usmjereno je na dobivanje specifičnog staničnog imunološkog odgovora koji je otkrio leziju ili uništavao zloćudne tumore.

                Budući da je protein HPV-a E6 / E7-specifičan antigen za karcinom povezan s karcinogenezom stanica zaraženih HPV-om, daljnja istraživanja primjene proteina E6 / E7 kao cilja imunoterapije protiv raka grlića maternice. U stvari, izvijestili su da je to bilo kod inhibicije ili odlaganja proteina HPV E6 / E7, sintetiziranog u mikrobni sustav, za miševe koji su koristili za zarazu tumorskih stanica (Gao, L. i sur. J. Gen. Violet., 75: 157). 1994, Meneguzzi, G. i sur., Virology, 181: 62, 1991). Međutim, kada se koriste cjepiva protiv živih virusa, kao i u drugim slučajevima, mogu postojati problemi s prekomjernim porastom virusa. Stoga su živa virusna cjepiva, u mnogim slučajevima koja se koriste samo u istraživačke svrhe, u nepovoljnom položaju na tržištu već dugo vremena i zahtijevaju značajna klinička ispitivanja.

                A aktivni se prati razvoj cjepiva, bakterijske vektora, uključujući i kaže se da HPV-16 VLP sintetizirati u oslabljenog Salmonella tifimuriju da proizvodnja protutijela specifičnih za antigen u sluznicu ili cjelokupnog tijelo miševa (Denis, N. et al aktivira., Infection and Immunity 65 (1997), 3328). Za cjepiva sintetskih peptida samo potrebne za imuni odgovor epitope izlaganja i epitopa E6 / E7 induciraju citotoksičnih T-limfocita (CTL) odgovora za HPV 16, koji su već poznati, sintetizirani za cijepljenje (Ressing biti ME). .. i suradnici, J. Immunol, 154: 5934, 1995).

                Uz ove eksperimente, istraživanja o uporabi transgenih biljaka (dobivenih iz povrća, uključujući rajčicu i krumpir) kao oralnih cjepiva ili jestivih cjepiva za proizvodnju virusnih antigena u biljkama. Tipični primjeri takvih cjepiva uključuju površinske čestice antigena hepatitisa B (Thavala, YF i Artzen, CJ, Pro Natl Acad Sci USA, 92: 3358, 1995) i kapsidni protein i papiloma virus L1 i L2 (Sl. Korejski registarski broj (međutim, biljni sustavi imaju problem u njihovoj komercijalnoj upotrebi koji je ograničen niskom razinom izraženih proteina HPV L1 i problemima povezanima s pročišćavanjem.

                Budući da je populacija zaražena HPV-om većim dijelom koncentrirana u zemljama u razvoju, hitno je razviti postupak za proizvodnju antigena HPV na ekonomičnoj i stabilnoj osnovi za sprečavanje i liječenje raka usta ili genitalija. što je uzrokovano papiloma virusima.

                Izumitelji su prethodno razvili vektor za efikasnu ekspresiju proteina HPV proteina na površini transformisanih rekombinantnih mikroorganizama i metodu za ekspresiju proteinskog antigena HPV na površini mikroorganizama (Korejski patent br. 0609.866).

                U skladu s tim, izumitelji ovog izuma uložili su velike napore na razvoju vektora na površini transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline na površini transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline koji bi mogli stabilno i konstitutivno eksprimirati proteine ​​HPV antigena i utvrdili su da stabilniji HPV antigen izražava se u visokim koncentracijama u rekombinantnim mikroorganizmima. transformiranih ovim vektorom. koji sadrži mutirani repE gen i na taj način dovršava ovaj izum.

                Glavni cilj ovog izuma je osigurati vektor sposoban za stabilnu, konstitutivnu ekspresiju velikih količina proteina antigena HPV-a na površini transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline primjenom mutiranih genskih repova.

                Drugi cilj ovog izuma je osigurati rekombinantne bakterije mliječne kiseline transformirane ekspresijskim vektorom i metodu za proizvodnju proteina HPV antigena koristeći bakterije mliječne kiseline.

                Sljedeći cilj predloženog izuma je osigurati cjepivo za liječenje karcinoma grlića maternice koja sadrži ove transformirane rekombinantne bakterije mliječne kiseline.

                Da bi se postigli gornji ciljevi, ovaj izum pruža površinski ekspresijski vektor koji sadrži: mutirani repE gen koji ima aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 1; promotor; Kompleks je kompleksni gen, poli-gama-glutamat sintetaza i gen povezan sa složenom genom sintetazom poli-gama-glutamatom i koji kodira humane proteinske antigene, papiloma virus, za indukciju tumora povezani.

                Predmetni izum također osigurava rekombinantni mikroorganizam transformiran s vektorom.

                Predmetni izum također pruža cjepivo za liječenje raka grlića maternice, koje sadrži rekombinantni mikroorganizam kao aktivni sastojak koji sadrži HPV antigen sličan protein eksprimiran na svojoj površini.

                Predmetni izum također osigurava postupak za proizvodnju mikroorganizma koji sadrži antigen HPV-a izražen na njegovoj površini, a postupak uključuje korake: rekombinantni mikroorganizam koji je transformirao kulture vektorske ekspresije HPV-a na površini mikroorganizma ; i kolekcija rekombinantnog mikroorganizma koja sadrži antigen HPV izražen na njegovoj površini.

                Predmetni izum također pruža cjepivo za liječenje raka grlića maternice, koje kao aktivni sastojak sadrži mikroorganizam izveden iz gornje metode i koji sadrži antigen HPV izražen na svojoj površini.

                Kratak opis brojeva

                Slika 1 prikazuje mapu cijepanja pKV Pald-PgsA amilaze u koju smo uveli mutirani repE gen.

                Slika 2 prikazuje mapu distribucije dvije vrste ekspresijskih vektora koji eksprimiraju gen E7 na površini mikroorganizama.

                Slika 3 prikazuje rezultate analize Western blot-a za ekspresiju E7 na površini bakterija mliječne kiseline transformiranih pKV-Pald-PgsA-E7.

                Slika 4 prikazuje graf unosa bakterija mliječne kiseline u miša kako bi se ispitala sposobnost transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline koje eksprimiraju E7 na svojoj površini da izazivaju imunološki odgovor.

                Slika 5 prikazuje promjene u IgG i IgA nakon oralne primjene transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline koje eksprimiraju E7 na svojoj površini.

                Slika 6 prikazuje rezultate analize E7-specifične sekrecije IFN-gama oralnim davanjem transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline koje eksprimiraju E7 na svojoj površini.

                Slika 7 prikazuje rezultate analize tumora tumora provedene oralnim davanjem transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline koje eksprimiraju E7 na svojoj površini i određivanja povećava li se veličina tumora.

                Sl. 8 prikazuje mapu distribucije ekspresijskog vektora koji eksprimira gen E7 (Rb) na površini mikroorganizama.

                Slika 9 prikazuje rezultate analize ekspresije E7 (Rb) na površini rekombinantnih bakterija mliječne kiseline transformiranih pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb).

                Slika 10 prikazuje rezultate imunološkog ispitivanja specifičnog za E7 (ELISA).

                Slika 11 prikazuje rezultate analize izlučivanja IFN-gama za E7 (Rb) nakon oralne primjene transformiranih rekombinantnih bakterija mliječne kiseline koje eksprimiraju E7 na svojoj površini.

                Prvi aspekt izuma odnosi se na površinski ekspresijski vektor koji sadrži: mutirani repE gen koji kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; promotor; Kompleks je kompleksni gen, poli-gama-glutamat sintetaza i gen povezan sa složenom genom sintetazom poli-gama-glutamatom i koji kodira humane proteinske antigene, papiloma virus, za indukciju tumora povezani.

                U ovom izumu modificirani su mutantni repovi za mikroorganizam koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, koji se mogu stabilno održavati u transformiranim mikroorganizmima, zajedno s promotorom, aldolasom (Palden), dobivenim iz gena Aldolase Lactobacillus casei. Slijedom toga, povećala se ekspresija ciljnog proteina u mikroorganizmima. Da bi se potvrdilo da se šatralni vektor iz ovog izuma stabilno održava u rekombinantnim mikroorganizmima i da je ciljni protein eksprimiran u rekombinantnim mikroorganizmima, gen amilaze ubačen kao ciljni gen u rekombinantne mikroorganizme i analizira ekspresiju amilaze u rekombinantnim mikroorganizmima.

                Pored toga, za površinsku ekspresiju ciljnog proteina, gen sa složenim motivom poligamma-glutamat sintetaza je smješten na površini tako da se eksprimira u obliku povezanom s ciljanim proteinom. U ovom slučaju, složena genska poligamma-glutamat sintetaza je ponajprije pgsBCA, a poželjnije pgsA (Korejska patentna prijava br. 469800).

                U jednoj izvedbi ovog izuma, gen koji kodira HPV16 E7 povezan je s pgsA tako da je protein HPV16 E7 kao ciljni protein povezan s C-krajom PgsA da tvori pKV Pald PgsA E7 vektor što se može konstitutivno izraziti. HPV antigenski protein na površini bakterija mliječne kiseline. Ekspresijski vektor je također ubačen u Lactobacillus casei da se dobiju transformirane rekombinantne bakterije mliječne kiseline koje eksprimiraju protein HPV antigena.

                Ovdje se koristi termin "ciljni protein" ili "strani protein" Izraz “protein” odnosi se na protein koji se obično ne nalazi u transformiranim stanicama domaćina koji eksprimiraju protein. Na primjer, kada se manipulira da je protein mlijeka ili izvora tumora umjetno eksprimiran u bakterijama mliječne kiseline, taj se protein navodi kao strani protein ili ciljni protein.

                U drugom aspektu, ovaj se izum odnosi na rekombinantni mikroorganizam transformiran s vektorom, rekombinantni mikroorganizam koji na svojoj površini ima protein antigena HPV-a i cjepivo za liječenje raka grlića maternice, koji pretvara rekombinantni mikroorganizam u aktivni sastojak ,

                Ovdje se koristi termin "domaćin"ili "organizmi" se odnosi na bakterije mliječne kiseline koje su probiotske Gram-pozitivne bakterije, a opći kriteriji za izbor probiotskih mikroorganizama uključuju: (i) mikroorganizam koji potiče od čovjeka; (Ii) otpornost na žuč, kiseline, enzime i kisik; (Ii) sposobnost zadržavanja crijevne sluznice; (IV) potencijal kolonizacije u ljudskom gastrointestinalnom traktu; (V) priprema antimikrobnih sredstava; i (VT) prividna učinkovitost i sigurnost. Ovi kriteriji jasno pokazuju da su mliječne kiseline prijateljske i bezopasne za ljudsko tijelo. Kada se transformanti ljudskog tijela mliječne kiseline koje se koriste za dostavu gena ili proteini koriste za prevenciju ili liječenje bolesti, za razliku od konvencionalne metode koja se koristi za pravljenje cjepiva za proizvodnju bakterijskih sojeva, fazni bakterijski sojevi detoksikacije nisu potrebni.

                U ovom izumu, bakterije mliječne kiseline koje se koriste kao domaćini uključuju Lactobacillus sp. Streptococcus sp. i Bifidobacterium sp. Normalno, Lactobacillus sp. Tu se ubrajaju L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. delbrückii, L. johnsonii, L. reuteri i L. bulgaricus, zvani Streptococcus sp. uključuje S. thermophilus i Bifidobacterium sp. B. Infantis, B. Bijidum, B. Longum, B. Pseudolongum, B. Breve, B. Lactis Bb-12 i B. Adolescentis. Poželjno, Lactobacillus sp.

                Drugi aspekt izuma odnosi se na postupak proizvodnje mikroorganizma koji sadrži HPV izražen na njegovoj površini, pri čemu postupak uključuje korake: transformacije rekombinantnog mikroorganizma s vektorom za ekspresiju antigena HPV na površini mikroorganizma , kao i zbirka rekombinantnog mikroorganizma koji sadrži antigen HPV. izraženo na njegovoj površini.

                Uzgoj rekombinantnih mikroorganizama prema ovom izumu može se provesti postupkom poznatim u struci, a uvjeti kulture, uključujući temperaturu i vremena kulture, te pH medija mogu se adekvatno nadzirati. Skupljanje rekombinantnih mikrobnih stanica iz tekućine u kulturi može se obaviti uobičajenim tehnikama izolacije, na primjer centrifugiranjem ili filtriranjem.

                Drugi aspekt ovog izuma odnosi se na cjepivo protiv raka grlića maternice, koje kao aktivni sastojak sadrži mikroorganizam dobiven ovom metodom i koji sadrži antigen HPV izražen na površini.

                Pored toga, ovaj izum se odnosi na cjepivo za liječenje raka grlića maternice, koje se daje oralno.

                Vakcine su lijekovi koji koriste žive organizme da spriječe bolest s ciljem da potaknu imunološki sustav. Imunoaktivacija se odnosi na postupak učinkovitog uklanjanja antigena stvaranjem antitijela u organizmu, stimuliranjem T-limfocita ili stimulacijom drugih imunoloških stanica (npr. Makrofaga). Stručnjaci razumiju detaljno proučavanje imunologije povezane s takvim detaljima (Barrett J.T., Textbook of Immunology, 1983). Vakcina s transformiranim mikroorganizmom koji eksprimira ciljni protein kao antigen može se primijeniti sisavcu, poželjno čovjeku.

                Unos cjepiva može se provesti prema standardnim metodama. Doza prikladna za primjenu ovisi o antigenosti genskih proizvoda i može biti ista količina pri kojoj cjepivo može učinkovito izazvati specifične imunološke odgovore. Doza se može lako odrediti rutinskim eksperimentalnim postupcima. Tipična početna doza cjepiva je 0,001-1 mg antigena / kg tjelesne težine. Ako je potrebno, doza se može povećati kako bi se osigurala povoljna razina zaštite ili se cjepivo može dati nekoliko puta. Doziranje može odrediti stručnjak u području i može varirati ovisno o putu pripreme, načinu primjene, dobi pacijenta, tjelesnoj težini, spolu, težini bolesti, prehrani, učestalosti primjene, načinu primjene, stupnju izlučivanja i osjetljivosti.

                Najpoželjnija izvedba vektora površinske ekspresije izuma za proizvodnju HPV cjepiva koje kodira E7 antigenski protein HP7. Vektor koji sadrži površinsku ekspresiju gena koji kodira mutirani protein artičoke koji ima aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 1; promotor aldolaze dobiven iz bakterija mliječne kiseline; složen gen za poligamma-glutamat sintetazu odabran iz skupine koja se sastoji od pgsB, pgsC i pgsA za površinsku ekspresiju; i gen koji kodira humani papiloma virus E7 povezan s indukcijom tumora i povezan sa složenim genom sintetaze poligamma-glutamata. Rekombinantne bakterije mliječne kiseline transformirane ovim vektorom mogu se uzgajati na njihovoj površini ekspresijom antigenog proteina HP7 E7, a zatim koristiti izravno kao cjepivo.

                Najpoželjnija izvedba vektora površinske ekspresije izuma za proizvodnju HPV cjepiva koje kodira E7 (Rb), antigeni protein je površinski ekspresijski vektor koji sadrži gen koji kodira mutantni protein artičoke koji ima aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 1 uključuje: promotor aldolaze dobiven iz bakterija mliječne kiseline; složen gen za poligamma-glutamat sintetazu odabran iz skupine koja se sastoji od pgsB, pgsC i pgsA za površinsku ekspresiju; i gen koji kodira humani antigeni protein papiloma virus E7 (Rb) povezan s indukcijom tumora i složenom sintezom polimerne gama-sintetaze. Rekombinantne bakterije mliječne kiseline transformirane ovim vektorom mogu se uzgajati da bi se eksprimirao E7 HPV (Rb) antigen na njihovoj površini, a zatim koristiti izravno kao cjepivo.

                Da bi cjepivo bilo učinkovito u proizvodnji protutijela, antigene tvari treba otpustiti in vivo da bi se stvorio mehanizam protutijela za cijepljene pojedince. Stoga mikrobni nosač genskog produkta za imunološke odgovore treba uvesti in vivo. Da bi se promovirao pozitivan odgovor na antigen predstavljen transformiranim rekombinantnim bakterijama mliječne kiseline ovog izuma, cjepivo će se poželjno primijeniti oralno ili direktno sa grlićem maternice, kao sprej za nos.

                Za oralnu primjenu sastava cjepiva subjektu, pripravak cjepiva je poželjno dostupan u liofiliziranom obliku, na primjer u obliku kapsula. Kapsula djeluje kao želučani premaz koji sadrži Eudragate S, Eudragate L, celulozni acetat, ftalat celuloze ili hidroksiprolilmetilcelulozu. Kapsula se može rekonstituirati nakon rekonstitucije ili ubrizgati u liofilni materijal, poput suspenzije. Redukcija se provodi ponajprije u puferu pri pH prikladnom za preživljavanje transformiranih rekombinantnih mikroorganizama. Da bi se zaštitilo transformirano rekombinantno cjepivo protiv mikroorganizama i želučane kiseline, prikladno je uvesti pripravak sode bikarbone prije svakog cjepiva. Cjepivo se može pripremiti selektivno za parenteralnu primjenu, intranazalno davanje ili intramamarnu primjenu (unutar dojke).

                U nastavku će se ovaj izum detaljnije objasniti pomoću primjera. Stručnjacima će biti očito da su ovi primjeri samo ilustrativni i da ih se ne treba tumačiti kao ograničavanje opsega izuma. Stoga su prikazani sljedeći koraci koji ne ograničavaju opseg izuma.

                Primjer 1: Dobivanje površinskog vektora ekspresije (pKV-Pald-PgsAL-amilaza) koji sadrži mutirani repE gen

                U ovom slučaju, konstruiran je površinski ekspresijski vektor koji je sadržavao mutirani repE gen i povećanu razinu ekspresije ciljnog proteina za stabilizaciju ekspresijskog vektora u stanicama domaćina.

                Najprije je dobiven fragment promotora aldolaze dobiven iz Lactobacillus casei da se dalje poveća ekspresija ciljnih proteina u bakterijama mliječne kiseline. 2 i SEQ ID NO :: Promotorska aldolaza dobivena je PCR upotrebom PDT-PgsA-amilaze (otkrivena u Korejskoj patentnoj publikaciji br. 10-2008-0086161) kao predloška i po mogućnosti SEQ ID NO 3.

                SEQ ID NO: 2: 5′-cgc gca tgc aat cac tta ttg cg-3 ‘

                Rezultat je bio fragment DNA od 421 bp koji sadrži promotor aldolaze, restrikcijsko mjesto SphI na kraju 5. SEQ ID NO: 3: 5′-cag ttc ttt ttt cat cathatat, itd. C-3 ‘Rezultat je bio fragment DNA od 421 bp koji sadrži promotor aldolaze ‘u N-. priključna pgsA veličina 17 str. na 3’-kraju. Pored toga, koristili smo PCR fragment pgsA gena koji se može priključiti na gore, promotor aldolazni fragment se sastoji od PCR kao što je gore opisano kao predložak, a posebno SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5.

                SEQ ID NO: 4: 5′-gga gga učinio mačku gaaaa aga čin g-3 ‘

                SEQ ID NO: 5: 5′-ggc daje gggt ggt cgt ttg g-3 ‘

                Dobiveni fragment DNA bio je fragment 782 bp koji je sadržavao 13 bp. 3 ‘kraj promotora aldolaze i sadrži pgsA koji je izravno priključen na njega. PgsA regija ovog fragmenta sadrži mjesto restriktivnog enzima PstI.

                Dva dobivena fragmenta su linearna i podvrgnuta su PCR upotrebom primera na oba kraja da bi se dobio fragment DNA od 1175 bp. Fragment DNK je digestiran sa SphI i Pstl da bi se dobio fragment koji sadrži promotor aldolaze i N-terminalnu regiju pgsA.

                PBT: pgsA-amilaza (PAT Ps1pA-pgsA-amilaza, vidi neizravni primjer Korejske patentne prijave br. 0.872.042), imamo probavni sustav sa SphI i PstI za uklanjanje reklamne regije SlpA7 i N-kraj pgsA stvoriti za ekspresijski vektor.

                Promotorska aldolaza koja sadrži fragment DNA razgrađen SphI i PstI ligiran je s PBT: PslpA-amilaza digestirana s istim restrikcijskim enzimima da bi se dobila PAT-Palden PgsA-amilaza. Vektorska PAT Palden-Pgs-amilaza podvrgnuta je gradskoj mutagenezi da zamijeni TTA kodon, kodirajući gen 475-tog leukovog aminokiselinskog kiselina s kodonskom TGA stazom da bi odsjekao amino 21E-terminalne proteinske REE kiseline za izgradnju CSR-a -Palden. PgsA amilaza koja ima aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 1 (1).

                Primjer 2: Dobivanje vektora površinske ekspresije HPV16 E7 (pKV-Pald-PgsA-ET)

                Korištenjem vektora površinske ekspresije (CSR-Palden-PgsA-amilaza) pripremljenog u primjeru 1, uveli smo gen koji kodira protein HPV16 E7 u C-kraj PgsA uveo je vektor CSR-Palden-PgsA-E7 koja je sposobna izraziti ciljni protein na površini bakterija mliječne kiseline. ,

                U tu svrhu, gen, amilaza, koji se izlije u pgsA u vektoru CSR-Palden-PgsA-amilaze dobivenom u Primjeru 1, i umetnuti vektorski gen koji kodira HPV16 E7. Kao što je prikazano na slici 1, fragment koji sadrži gen HPV16 E7 dobiven je PCR pomoću Phat: PgsA-E7 (Poo i sur., Int J. Cancer, 119, 1702, 2006.) Kao predložak i SEQ ID NE prajmerje: 6 i ZAPOR. ID. Br .: 7

                SEQ ID NO: 6: 5′-gcg gga tec mačka gga gat djeluje aca ttg c-3 ‘

                SEQ ID NO: 7: 5′-acg cag aag ei ​​tct gat aa-3 ‘

                Kao rezultat, dobiven je fragment od 386 bp koji sadrži gen HPV16 E7. Fragment je sadržavao restrikcijski enzim BamHI na 5′-kraju i XbaI restrikcijski enzim na kraju 3′-kraja. Dobiveni fragment DNA digestiran je s BamHI i XbaI da bi se dobio fragment od 306 bp.

                Vektor pKV-Pald-PgsA-amilaze digestiran je s BamHI i XbaI radi uklanjanja dijela gena amilaze kako bi se dobio vektorski fragment.

                Ulomak DNA koji sadrži E7 gen razgrađen s BamHI i XbaI ligiran je vektorom, digestiran s istim restrikcijskim enzimima da se dobije CSR-Palden-PgsA-E7 (Slika 2A).

                Primjer 3: Ekspresija ekspresije pHAT: PgsA-E7 i pKV-Pald-PgsA-E7 u transformiranim bakterijama mliječne kiseline

                U ovom su slučaju Lactobacillus casei transformirani s pHAT: PgsA-E7 i pKV-Pald-PgsA-E7 konstruiranim u primjeru 2. Transformirani rekombinantni soj Lactobacillus casei uzgajan je i testiran na ekspresiju proteina E7 u rekombinantnom soju. Ekspresija proteina povezanog s PgsA E7 ispitivana je u transformiranom rekombinantnom soju bakterije Lactobacillus casei.

                Rekombinantni soj Lactobacillus casei transformiran je sa svakim phatom: PgsAE7 i CSR-Palden-PgsAE7 uzgajani su u MRS medijumu (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson, koji neprekidno uzgaja Company Sparks, USA) na 30 ° C da bi se izazvala površinska ekspresija proteina HPV167 E7 , Sinteza poli-gama-glutamata povezana s C-krajem pgsA gena.

                Cijele stanice kultiviranog soja Lactobacillus casei podvrgnute su SDS-poliakrilamidnom elektroforezi i Western blotu koristeći protutijela specifična za PgsA.

                Konkretnije, cijele stanice transformiraju se s rekombinantnim sojem Lactobacillus casei u kojem se inducibilna ekspresija gena za denaturirani E7 daje u istoj staničnoj koncentraciji kao u pripremi uzorka. Uzorak je analiziran pomoću elektroforeze SDS-poliakrilamidnog gela, a zatim je proteinska frakcija prenesena u membranu polivinilidena fluorid-difluorida (PVDF) (Bio-Rad). PVDF membrana na koju su prenesene proteinske frakcije blokirana je miješanjem u puferu za blokiranje (50 mM Tris-HCl, 5% obrano mlijeko, pH 8,0) 1 sat, a zatim je 1 sat inkubirana s poliklonskim zečjim anti- PgsA zadržani. Primarno antitijelo razrijeđeno je 1000 puta sa blokirajućim puferom. Nakon inkubacije, membrane se isperu s puferom i inkubiraju 1 sat sa zečjim sekundarnim antitijelom konjugiranim na hrenov peroksidazu (HRP), razrijedenim 10 u blokirajućem puferu, isperu 000 puta. Nakon završetka inkubacije, membrane se isperu s puferom, isperu s membranama oko 1 minute nakon dodatka supstrata (Lumigen PS-3 akridan, H).2O.2) i specifično vezanje između PgsA-specifičnog antitijela i fuzijskog proteina opaženo je korištenjem CCD kamere (3).

                Na slici 3, C-bend se transformira s rekombinantnim sojevima Lactobacillus casei koji eksprimiraju samo PGSA (CSR-Palden-PGSA), linija 1 koja transformira ekspresiju proteina iz rekombinantnog soja Lactobacillus casei s Phatom: PGSA-E7, i linija 2 prikazuje ekspresiju rekombinantnog proteina Lactobacillus casei transformiranog s pKV-Pald-PgsA-E7. Kao što je prikazano na slici 3, na linijama 1 i 2 primijećeni su uz uporabu antitijela specifičnih za ekspresiju PgsA 54.4 kDa PgsA-E7 antitijela i opaženo je u kojem je primijećena ekspresija fuzijskog proteina PgsA-E7 s genomom CSR-Palden PgsA -E7. je bio veći od ekspresije fuzijskog proteina PgsA-E7 pomoću pHAT gena: PgsA-E7.

                U slučaju strukture u kojoj PSLP-PgsA-E7 sadrži phat: PgsA-E7 zamjenjuje normalni gen REE zamijenjen bakterijama mliječne kiseline transformiranim Palden-PgsA-E7, ne može se dobiti kako je opisano gore da osigura transformirane bakterije mliječne kiseline.

                Primjer 4: Usporedba sposobnosti induciranja humoralnih imunoloških odgovora između sojeva laktobacila koji eksprimiraju antigen HPV16 E7 na svojoj površini.

                Lactobacillus casei transformiraju se sa svakim površinskim ekspresijskim vektorima, a ekspresija antigena E7-HPC na površini sojeva inducirana je na isti način kao u primjeru 2. Potom smo usporedili dvije vrste transformiranih rekombinantnih sojeva Lactobacillus casei sa sposobnošću hibridnog proteina PgsA-BP416 E7 da inducira humoralni imunološki odgovor. , Zatim su miševi dobili dva soja s različitim nivoima ekspresije fuzijskih proteina u različitim količinama (1, 1/5 i 1/10) i uspoređeni sa sposobnošću induciranja imunoloških odgovora.

                Sev Lactobacillus casei transformiran je sa svakim od vektora, uzgojen, mljeven i sublimiran da bi se stvorila prašina. Prah je otopljen u puferu (PBS, pH 7,4), a zatim se oralno davao Balb miševima koji su trajali 6 tjedana.

                Konkretno, svaki smrznuti sušeni prah transformiranih rekombinantnih sojeva Lactobacillus casei (Phat-E7 i CSR-E7) koji eksprimira antigen HPV 16 E7 i soj Lactobacillus casei (PAT) ne eksprimira solubilizirani antigen HPV16 E7 , u PBS u različitim koncentracijama (PAT) × 109 stanica / 200 ml, 1 × 10 9 stanica / 200 ml i 5 × 10 8 stanica / 200 ml) i imunizirani miševi pet puta tjedno u trajanju od 2 tjedna (dani 0-4 i dani 7- 11). Nakon tjedan dana dala je prvu potisnu injekciju oralnom primjenom (21-25 dana), nakon tjedan dana, dok je drugu oralnu injekciju dala oralno (35 do 39 dana). Za mjerenje IgG specifičnog protutijela IgG u mišjem serumu i X-E6 E7 specifičnih protutijela na IgA koje luče mišja sluznica uklonjena je crijeva za ispiranje crijeva i vaginalno ispiranje miševa kod svakog miša tijekom 14, 28 i 42 dana (Slika 4). Naime, krv je prekrivena iz mišjeg oka mikrokapilarne epruvete pomoću heparina, a vaginalno ispiranje crijeva je sakupljeno u 0,8 ml i 250 ml upotrebom pufera PBS koji sadrži 1 mM PMSF. Svako pranje se zatim centrifugira pri 13.000 okr / min. U roku od 20 minuta, supernatant je sakupljen i podvrgnut ELISA.

                Za analizu ELISA-e, protein u BPH16 E7 bio je pufer za oblaganje (0,1 M natrijev karbonat, 0,02% natrijev azid, pH 9,6) u koncentraciji od 500 ng / 100 L, otopljen u jažici, a zatim 100 ml razrjeđenje je dodano 96 ml. Ploče ELISA inkubiraju se preko noći na 4 ° C. ELISA ploče, isperu se tri puta s PBST (PBS sa 0,05% Tween20), dodaju se 300 μl / jažici, a zatim blokiraju na ELISA ploči sa 100 μl 5%. Otopljeno mlijeko 1 sat na 37 ° C, nakon čega slijedi uklanjanje blokirajućeg pufera. Ploče su tada utrostručene s PBST i 100 pm Na ploče su dodani razrijeđeni serum i sluznica. Nakon dodavanja uzorci s ploča inkubiraju se 2 sata na 37 ° C i zatim tri puta isperu s puferom za ispiranje. Zatim su protutijela konjugirana s peroksidazom iz hrena, IgG ili IgA razrijeđena s 1: 5000 antitijela, dodana su u svaku jažicu i inkubirana 1 sat pri 5 ° C 5M sumpornoj kiselini na 37 ° C. Količina specifičnog antigena za VRS16 E7 analizirana je mjerenjem u ELISA na 450 nm.

                Kao rezultat slike 5A, skupine koje su primale pAT-E7 i pKV-E7 pokazale su više OD vrijednosti u odnosu na kontrolnu skupinu nakon prosječne optičke gustoće optičkog IgG (OD), specifičnog za EEG, E7 nakon 2 tjedna imunizacije je izmjereno. pat. Nadalje, otkriveno je da se broj antitijela specifičnih za E7 povećava ovisno o broju uvedenih sojeva. Srednja vrijednost OD u serumu IgG specifična za E7 nakon prve potisne injekcije povećana je u skupinama tretiranim PAT-om, a CSR-E7 u usporedbi s vrijednošću izmjerenom nakon 2 tjedna imunizacije koja sadrži Učinak ponovne cijepljenja pokazuje. Srednja vrijednost OD7 specifičnog seruma IgG nakon druge potisne injekcije također je pokazala učinak pojačivača u obje skupine liječenja. Konkretno, u skupini koja je primala CSR-E7 u kojoj je površinska ekspresija hibridnog proteina E7 bila značajno veća od skupine koja se hrani pat-E7, ova grupa je ubrizgavala u CSR-E7 u količini 1/5 Međutim, učinak pojačavanja porasta razine IgG sličan je efektu 1/7 štakorske E7 skupine.

                U međuvremenu, ELISA je izmjeren imunološki odgovor sluznice specifične za E7-IgA protutijela u crijevnom i vaginalnom ispiranju. Kao rezultat, kao što je prikazano na slikama 5B i 5C, prosječna vrijednost OD (npr. Specifična za IgA specifičan za E7) koja je prikazana nakon 2 tjedna imunizacije u obje tretirane skupine uspoređena je s PAT-E7 i CSR-E7 s kontrolom. PAT grupa i količina protutijela specifičnih za E7 povećali su se prema količini uvedenog soja. Prosječni OD nakon prvog potisnog ubrizgavanja se povećao, a učinak drugog potisnog ubrizgavanja bio je nešto veći od učinka prvog poticajnog ubrizgavanja.

                Kada je dovršen, može se transformirati s rekombinantnim sojevima bakterije Lactobacillus casei iz izuma da se izrazi HPV16 E7, koji se može davati oralno da se inducira humoralni imunološki odgovor pomoću HPV16 E7 (indukcija serumskog IgG) i imunološkog odgovora sluznice ( Indukcija crijevnih / vaginalnih IgA). Konkretno, skupina koja izražava CSR E7 primila bi viši E7 mogla inducirati učinkovite imunološke odgovore u usporedbi s grupom koja prima pat E7.

                Primjer 5: Usporedba sposobnosti induciranja staničnih imunoloških odgovora između sojeva laktobacila koji eksprimiraju na svojoj površini antigen HPV16 E7.

                Ispitali su razlikuju li se dva tipa transformiranih rekombinantnih sojeva Lactobacillus casei (Phat-E7 i CSR-E7) s različitim razinama površinske ekspresije antigena HPV16 E7 u sposobnosti da razlikuju E7-specifični antigen od imunološkog odgovora na CD8 + T stanice T i da induciraju imunološke reakcije T7 i T stanica, oralno su izvedeni bojenjem unutarćelijskog citokina i proizvodnjom IFN-y ELISPOT upotrebom miševa koji su davani svakom od sojeva, a koji su ispitivali sposobnost sojeva Da potaknu imunološke reakcije.

                U tu svrhu, miševima su davani oralno sa svakim transformiranim rekombinantnim sojem Lactobacillus casei koji je eksprimirao E7 na njihovoj površini kao izolirani u Primjeru 4 splenocitima. Splenociti su inokulirani u 10% RPMI-1640 medijum s FBS i suspendirani u 24-jažici sa gustoćom 5 x 106 stanica / jažici. Svaka jažica je tretirana peptidom E7 koji sadrži epitop MHC klase I (aminokiseline 49-57, AniGen, Koreja) i GolgiPlug (BD Biosciences), a stanice su rasle na 37 ° C 16 sati. Kultivirane stanice obojene su na 4 ° C monoklonalnim antitijelom CD8 fikoetrinrinim na 4 ° C konjugiranim antitijelesnim antitijelom i IFN-y u stanicama obojenim s FITC-konjugiranim monoklonskim štakorima protiv IFN-y ploče Cytofix / Koristite citoperm.

                Kao što je gore opisano, nakon oralne primjene svakog od dva rekombinantna Lactobacillus casei u miševa obojeni su unutarćelijski citokini radi određivanja količine CD7 + T stanica koje izlučuju IFN-γ E7. Kao što je prikazano na slici 6, E7 izražava povećanje broja specifičnih za E7 CD8 + T-25 koji izlučuju IF7 + T-25 koji ubacuju transformirani rekombinantni soj bakterije Lactobacillus casei. Konkretno, u početnoj fazi kada su bili inducirani imunskim odgovorima, bilo je jasno da stanično posredovani imuni odgovor inducirao je rekombinantni CSR E7 soj rekombinantnog laktobacilusa, koji je imao višu razinu površinske ekspresije, ali je blago porastao u odnosu na imunološke odgovore od bakterija pHAT mliječne kiseline. E7, ali ne imunološki odgovor uzrokovan stanično-injiciranim ubrizgavanjem mliječne kiseline Phat-E7, porastao je do razine slične soju CSR-E7.

                Da bismo proučili indukciju imunoloških odgovora na T stanice specifične za E7, izveli smo test ELNSPOT IFN-y za procjenu ukupnog broja T stanica koje su specifično izlučene IFN-γ s obzirom na stimulaciju E7 peptida , U tu svrhu, dan prije izolacije ploče s 24-jažici splenocita prevučene uzbudljivim mišjim anti-IFN-y protutijelom i izolirane na dan splenocita pokusa, inokulirane su u svaku jažicu pločice 2 x 10 5 stanica / Depresije. Svaka jamica taložnih stanica je tretirana peptidom E7 ili PHA-M i stanice su kultivirane 2 dana. Nakon 2 dana, sadržaj tableta se ukloni i dva puta inkubira destiliranom vodom i tri puta sa 0,05% PBS-om, Tween-20, zatim biotiniliranim anti-INF-y u svakoj jažici tablete i 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, uklanja se sadržaj ploča, od kojih se svaka jažica ispere tri puta sa 0,05% Tween-20 PBS, a zatim streptavidin-HRP se ispere na sobnoj temperaturi 1 sat u svakoj jažici ploče i inkubira. Tada se sadržaj tableta odbaci i svaka jažica se ispere četiri puta sa 0,05% PBS-a koji sadrži između 20 i 2 puta PBS-om. Zatim smo dodali supstrat u svaku jažicu i vidjeli razvoj boja u svakoj jažici 5 do 60 minuta. Reakcija razvoja boje zaustavljena je destiliranom vodom, a pomoću ELISPOT-a izmjeren je broj mjesta u svakoj jažici.

                Kao što je prikazano na slici 6, miševi su oralno tretirani s rekombinantnom bakterijom mliječne kiseline transformiranom s Phat-E7 ili CSR-E7, povećali su broj stanica koje posebno izlučuju IFN-γ u peptidu E7. Pored toga, broj stanica koje sadrže IFN-γ u skupini koja sadrži CSR-E7, malo je veći od broja stanica IFN-γ u skupini koja je primila rekombinantni soj, transformiran je sa rekombinantnim sojevima Lactobacillus-a casei, Lactobacillus casei, transformiran s pHAT-om. E7.

                Primjer 6: Provociranje tumorskih stanica u miševima imuniziranim laktobacilima koji eksprimiraju HP7 E7 antigen na površini

                Za potvrdu anti-tumorskog učinka dvije vrste rekombinantnih sojeva, Lacfobacillus (Granular-E7 i CSR-E7) s različitim razinama površinske ekspresije antigena HPV16 E7 i antitumorski učinak, ovisno o njihovom broju Za potvrdu, bile su izložene tumorskim stanicama kako bi tvorile tumor. TC-1 stanice koje eksprimiraju E7 protein.

                U tu svrhu, ženke miševa C57BL / 6, u dobi od 6-8 tjedana i podijeljene su u nekoliko skupina, od kojih svaka sadrži 5 životinja, a svaki se rekombinantni soj bakterije Lactobacillus casei transformira, izražavajući na površini E7 oralno administriran mišem. Oralna primjena provedena je pet puta tjedno, a miševi su tretirani prema sljedećem rasporedu: 1 tjedan oralnog unosa, 1 tjedan odmora, zatim 1 tjedan nakon prve injekcije ubrzanja, zatim 1 tjedan odmora, a zatim 1 tjedan još jedne stimulacije injekcije , Nakon oralnog davanja 10 tjedana, 2 × 4 TC-L tumorske stanice ubrizgavaju se supkutano u lijevo bedro svakog miša da induciraju tumore. Dobivena veličina tumora izmjerena je tri puta tjedno pomoću čeljusti.

                Kao što je prikazano na slici 7, u skupini u kojoj su oralno koristili rekombinantni soj Lactobacillus casei, oko 50 posto transformiranih veličina tumora transformiranih Phat-E7 ili CSR-E7 s manjom veličinom tumora u kontrolnoj skupini. Osim toga, u skupini u koju su ubrizgani rekombinantni soj CSR-E7 Lactobacillus casei u smanjenom volumenu 1/5, veličina tumora je manja nego u kontrolnoj skupini.

                Primjer 7: Priprema imuniziranih bakterija mliječne kiseline (CSR-Palden-PgsA-E7 (Rb)) koje na svojoj površini izražavaju protein, mutaciju aminokiselina unesenih u 16 u HPV tip, E7

                Kada su stanice zaražene virusom papiloma, može se eksprimirani protein E7 vezati na protein koji inhibira rast retinoblastoma (pRb), što dovodi do raka. U tu svrhu, mutacije u pRB-vezujućem području uvedene su u osnovni slijed gena E7. Gen uzrokovan mutacijom E7 (Rb) spojen je na kraju PgsA upotrebom pKV shuttle vektora koji se stalno eksprimira u Escherichia coli i mliječnoj kiselini na pKV-Pald PgsA-E7 (Rb) vektor oblik, koji je ekspresivan na površini. Mliječna kiselina. Bakterija.

                Rezultati ispitivanja će otkriti mjesta vezanja na Rb protein imaju papiloma virus E7 koji se veže na inhibitore proteina retinoblastoma (Rb) (DL × C × E), koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21-26 gena E7 iz HPV-16 (Mahmoud i sur., Virology, 281: 231 (2001) za sve aminokiseline 21 (D), 24 (C) i 26 (E) između aminokiselinskih ostataka 21-26 glicina, sposobnost proteina E7, koji se veže na protein koji veže pRb, eliminira točkovnu mutagenezu koristeći prajmov. Konkretno, PCR je dobiven pomoću vektora CSR-Palden-PgsA-E7 u primjeru 2 kao predloška i svakog skupa prajmov SEQ ID NOS. 8 i 9 i rečenica prajmov SEQ ID NO: 10 i 11.

                SEQ ID NO: 8: 5′-tct gga tcc atg mačka gga gat ac cct ac-3 ‘

                SEQ ID NO: 9: 5′-ttg ccc ata acc gta gag of agt tgt c-3 ‘

                SEQ ID NO: 10: 5′-nude ggt ctc tac ggt tat ggg caa tta aat g-3 ‘

                Seq.-ID br. 11: 5′-mačka ukupno aga tta tta tgg ttt ctg aga aca g-3 ‘

                Kao rezultat, s prajmov SEQ ID NO: 8 i 9, pronalazimo fragment DNA s 87 bp koji sadrži E7 gen HPV16 i 5 ‘kraj restrikcijskog enzima BamHI. Pored toga, koristimo prajmov SEQ ID NOS: 10 i 11 249 bp DNA fragment, koji sadrži mjesto restrikcijskog enzima XbaI na sadržaju 3’-kraja. Dva dobivena fragmenta DNA miješaju se zajedno i ispod 10 ciklusa PCR-a sastojalo se od 30 sekundi pri 95 ° C, 30 sekundi pri 42 ° C i 30 sekundi pri 72 ° C. Zatim nastavite na SEQ. ID. Brojevi 8 i 11 i PCR su ponovljeni (na 95 ° C 30 sekundi, na 53 ° C tokom 30 sekundi i na 72 ° C tokom 30 sekundi). Dobiveni fragment DNA od 312 p. jedna površina restrikcijskog enzima BamHI sadrži na kraju 5 ‘, a Xba I restrikcijski enzim na kraju 3’. Fragment je digestiran restrikcijskim enzimima BamHI i XbaI da bi se dobio mutantni fragment gena 306 bp E7 (Rb). CSR-Palden-PgsA-amilaza bila je probavna s BamHI i XbaI dijelom gena kako bi se uklonila amilaza da bi se dobio dio vektora. Fragment DNA koji sadrži mutirani gen E7 (Rb) digestiran s BamHI i XbaI ligiran je na vektor, digestiran s istim restrikcijskim enzimima da bi se dobio CSR-Palden-PgsA-E7 (Rb) (Slika 8) izgraditi.

                Konstrukcija pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb) elektroporirana je u slučaj Lactobacillus da bi se stvorile bakterije mliječne kiseline transformirane ovim konstruktom.

                Primjer 8: Ispitivanje ekspresije pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb) u transformiranim bakterijama mliječne kiseline

                Istražiti je li hibridni protein PgsA-E7 koji ima mutaciju na mjestu vezanja B, izražen u rekombinantnom Lactobacillus casei, transformiran vektorom CSR-Palden-PgsA-E7 (Rb) za ekspresiju na površini bakterija mliječne kiseline Sljedeći pokušaj izvršen je.

                Transformirani rekombinantni Lactobacillus casei uzgajani su u mediju MRS (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson) Sparks Company, SAD) na 30 ° C, mikrobne stanice se nakupljaju i analiziraju Western blot na isti način kao u primjeru 3. Rezultat je bio potvrđeni hibridni protein je eksprimiran u ovom mikrobnom soju. Konkretno, provodi se Western blotting, antitijela specifična za E7 PgsA i antitijela specifična za HPV16 (E7 monoklonsko antitijelo, Invitrogen, USA), i kao rezultat, kao što je prikazano na slici 9, ekspresija mutantnog proteina E7 potvrdio. oko 54,7 kDa spojeno na PgsA.

                Primjer 9: Indukcija imunoloških odgovora na ekspresiju laktobacila na površinski mutantnom antigenu HPV16 E7 (Rb)

                Rekombinantni soj Lactobacillus casei, za koji je potvrđeno da eksprimira mutantni protein E7 spojen na PgsA, oralno je dodijeljen mišu kako bi se istražila mogućnost induciranja humoralnih imunoloških odgovora. U tu svrhu, Lactobacillus casei transformiraju se s vektorom, uzgajaju se i zatim liofiliziraju radi dobivanja praha. Prah je otopljen u puferu (PBS, pH 7,4) i oralno dan 6-tjednim Balb / c miševima.

                Više transformirani rekombinantni soj ekspresije Lactobacillus casei (E7-Rb) HPV16 E7 (Rb) i soj Lactobacillus casei (L525) koji izražava HPV16 E7 (Rb) u koncentraciji u PBS-u izražava nespecifičnost, 2-5 x 10 9 stanica / 200 ml i zatim pet puta imunizirani miševi tjedno u trajanju od 2 tjedna (dani 0-4 i dani 7-11). Nakon jednog tjedna, prva ubrzana injekcija bila je oralna (21-25 dana), a druga oralna injekcija (35-39 dana) nakon prvog tjedna. Za mjerenje EGV-E7 specifičnog antitijela IgG u mišjem serumu i XA-E6 E7 specifičnih antitijela za IgA, koji se izlučuju iz mišje sluznice, uklanjajući crijevne pantere i vaginalne ispiranje miševa, svih 14, 28 i 28 42, kao što su navedeno. 4 Kao što je opisano u primjeru 4, dobiveno je iz krvi mišjeg oka pomoću mikrokapilarne epruvete obložene heparinom, crijeva i crijevna ispiranje prikupljeni su s 0,8 ml ili 250 μl, PBS puferom koji sadrži 1 mM PMSF. Svako sakupljeno ispiranje je centrifugirano na 13.000 okr / min tokom 20 minuta, a supernatant je sakupljen i analiziran ELISA na isti način kao u slučaju četvrtog

                Kao rezultat, kao što je prikazano na Sl. 10A, kada je skupina primjene E7-Rb nakon 2 tjedna nakon imunizacije za mjerenje srednje optičke gustoće (OD) serumskog IgG specifičnog za E7, pokazala je veću vrijednost OD od vrijednosti L525 (negativna kontrola ). Srednji OD, specifični IgG u serumu za E7, nakon prve potisne injekcije, usporedio je skupinu E7 Rb s onom izmjerenom nakon 2 tjedna imunizacije, pokazujući učinak ponovne cijepljenja. E7 specifični srednji OD u serumu za serum IgG također je pokazao učinak ponovljenog cjepiva. Međutim, skupina koja je uzimala L525 nije pokazala specifičan učinak nakon cijepljenja. Pored toga, za mjerenje šaljivih imunoloških odgovora uzrokovanih sluznicom, ELISA je izmjerena za svako crijevno i vaginalno spiralno specifično IgA antitijelo. Kao rezultat, kao što je prikazano na Sl. Slike 10B i 10C Pri 10C srednja vrijednost OD (specifična za E7 IgA) nakon dva tjedna imunizacije povećana je u skupini E7 Rb u usporedbi s L525 (negativna kontrola). Pored toga, prosjek se povećao, jer je prva potisna injekcija u usporedbi s izmjerenom vrijednosti nakon 2 tjedna imunizacije povećala učinak ostalih injekcija podražaja u usporedbi s poticajnim učinkom prve injekcije.

                Oralna primjena rekombinantnog soja E7-Rb miševima Lactobacillus casei mogla bi rezultirati svim sistemskim humoralnim imunološkim odgovorima (indukcija IgG seruma) i humoralnim imunološkim odgovorima specifičnim za HRFC16-E7 (IgA crijeva / vaginalna indukcija) ,

                Primjer 10: Indukcija staničnih imunih odgovora na laktobacilus ekspresiju mutantnog antigena HPV16 E7 (Rb) na svojoj površini

                Da bi se otkrilo da li transformirani rekombinantni soj laktobacila (E7-Rb) za određivanje površinske inducibilnosti E-specifični antigen (Rb) specifični imuni odgovor izražava mutirani HPV16 E7 antigen posredovan T stanicama, IFN izvedeno je -γ. ELISPOT je koristio miševe koji su oralno davali ovaj soj i testirao njihovu sposobnost izazivanja staničnih imunoloških odgovora. U tu svrhu se transformira rekombinantni soj Lactobacillus casei koji tretira mutirani E7 antigen HPV16 (Rb) na svojoj površini, konstruiran u primjeru 7, izražen oralno s mišem, zatim milonce izoliranu od miševa. Odabrani splenociti suspendirani su u mediju RPMI 1640 koji sadrži 10% FBS i inokulirani su u svaku jažicu 24 vdolbinicno ploče u gustoći 5 x 10 stanica. Svaka jažica je tretirana peptidom E7 koji sadrži epitop MHC klase I (aminokiseline 49-57, AniGen, Koreja) i GolgiPlug (BD Biosciences), a stanice su rasle na 37 ° C 16 sati. Kultivirane stanice obojene su 40 minuta monoklonalnim antitijelom antikoetrin (PE) anti-mišjim CD8 na 4 ° C, a IFN-y u stanicama se inkubirali s FITC-konjugiranim anti-mišjim IFN-y monoklonskim antitijelima pomoću skupa Cytofix / citopermi obojeni.

                Kao što je gore opisano, rekombinantni sojevi bakterije Lactobacillus casei davani su oralno svakom mišu, a zatim je izvršeno bojenje unutarćelijskih citokina da bi se odredio broj E7 (Rb) specifičnih CD8 + T stanica koje IFN-γ lučiti. Kao rezultat slike 6, uvođenje transformiranih rekombinantnih sojeva slučaja Lactobacillus e1 (E) koji eksprimiraju Rb povećalo se u broju E7 (specifični IFN-γ koji izlučuje CD8 + T-25 izlučujuće stanice secr CD8 + T-25). Konkretno, u početnoj fazi u kojoj su inducirani imuni odgovori, bilo je jasno da se imunološki odgovor dobiven od rekombinantnog CSR-E7 (Rb), Lactobacillus casei, koji je imao viši stupanj površinske ekspresije, lagano povećao u usporedbi s imunološkim odgovorima. Fermentacija PHAT-E7 (Rb), ali ne i stanično posredovani imuni odgovor koji je izazvala bakterija mliječne kiseline PHAT-E7 (Rb), koja nakon ubrizgavanja akceleratora iznosi na razinu sličnu onoj u CSR-E7 (Rb).

                Da bi se proučila indukcija imunih odgovora na T7 specifične T7 stanice, provedeno je ispitivanje ELNPOT-IFN-y za procjenu ukupnog broja T stanica koje izlučuju IFN-γ posebno da stimulira E7 peptid.

                U tu svrhu, dan prije izolacije ploče s 24-jažici splenocita prevučene uzbudljivim mišjim anti-IFN-y protutijelom i izolirane na dan splenocita pokusa, inokulirane su u svaku jažicu pločice 2 x 10 5 stanica / Depresije. Svaka jamica taložnih stanica je tretirana peptidom E7 ili PHA-M i stanice su kultivirane 2 dana. Nakon 2 dana, sadržaj tablete se ukloni i ispere dva puta destiliranom vodom i tri puta sa 0,05% PBS-om, Tween-20, zatim biotiniliranim antimijaškim IFN-γ u svakoj jažici tablete i 2 sata na sobnoj temperaturi inkubirati. Nakon inkubacije, uklanja se sadržaj ploča, od kojih se svaka jažica ispere tri puta sa 0,05% Tween-20 PBS, a zatim streptavidin-HRP se ispere na sobnoj temperaturi 1 sat u svakoj jažici ploče i inkubira. Tada se sadržaj tableta odbaci i svaka jažica se ispere četiri puta sa 0,05% PBS-a koji sadrži između 20 i 2 puta PBS-om. Zatim smo dodali supstrat u svaku jažicu i vidjeli razvoj boja u svakoj jažici 5 do 60 minuta. Reakcija razvoja boje zaustavljena je destiliranom vodom, a pomoću ELISPOT-a izmjeren je broj mjesta u svakoj jažici.

                Kao što je prikazano na slici 11, da su miševi oralno proizvedeni od rekombinantnih bakterija mliječne kiseline pripravljenih s Phat-E7 (Rb) ili CSR-E7 (Rb), broj povećanih stanica izlučuje se specifičnim peptidom E7 IFN-γ. , Pored toga, broj stanica koje su primile IFN-γ u grupi sezer koja je primila rekombinantni soj Lactobacillus casei pretvara se u CSR-E7 (Rb), koji je malo veći od broja stanica u njegovoj skupini IFN-γ koji je štakor transformiran u rekombinantni soj Lactobacillus casei. -E 7 (Rb).

                Iako je ovaj izum detaljno opisan s obzirom na specifične karakteristike, stručnjaci će razumjeti da se ovo otkriće odnosi samo na preferirano ostvarenje termina i ne ograničava opseg izuma.

                Kao što je gore opisano, rekombinantne bakterije mliječne kiseline transformirane na površinskom ekspresijskom vektoru predstavljenog izuma mogu eksprimirati humani antigen virus papiloma virusa (HPV) na površini, a sastav koji sadrži rekombinantne bakterije mliječne kiseline kao aktivni sastojak može se koristiti kao cjepivo protiv raka grlića materice. Rekombinantni rekombinantni soj koji tvori visoku razinu antigena HPV vrlo je učinkovit jer se može reproducirati u velikim količinama i primijeniti u obliku oralnog cjepiva ili izravno u vaginu.

                Leave a Reply